生細胞の脂質分解能: ハイパースペクトル中赤外光音響顕微鏡における新たなブレークスルー

脂質は細胞膜や エネルギー貯蔵分子の構造成分であるだけでなく 癌,肥満,糖尿病,心血管疾患しかし,生きた細胞内の異なるタイプの脂質を直接観察し区別することは,長い間技術的な課題に直面してきました.伝統的なフラウレッセンスのラベル付け方法は,ラベル付けの効率性によって制限されています細胞機能に対する特異性や潜在的な干渉は,ラベルのない光学技術では,似たような化学構造を持つ脂質分子を区別するのに苦労することが多い.

ネイチャー・メソッドは"ハイパースペクトラル指紋領域光音顕微鏡" (hyFOPM) という技術について研究を発表しました中央赤外線指紋領域の単一結合振動モードを活用することによってこの技術により,生体細胞におけるスフィンゴミエリン (SM) とコレステロール (Chol) のラベルフリー検出とダイナミック画像撮影が可能になります.

技術的原則
ほとんどのラベルフリー光学方法は,C-H伸縮振動領域 (約2800~3000cm−1) の信号に依存するが,この領域のスペクトル帯は様々な脂質で非常に似ている.異なるタイプを区別するのが難しくなります反対に,中赤外線指紋領域 (900~1730cm−1) は,分子のユニークな構造を反映する単一結合の振動情報を多く含んでいます.アミド結合の特徴的な吸収などエステル結合とステロイドリング

hyFOPMシステムの設計は,このコンセプトを中心に,調節可能な量子カスケードレーザーを刺激源として採用し,スペクトル解像度2cm-1で900×2932cm−1範囲をカバーしている.レーザーパルスは,光音信号を生成するためにサンプルを興奮させる超スペクトル画像の構築のために超音波変換器によって検出される.このシステムは,約4.3μmの空間解像度があり,生きた細胞レベルでの画像撮影が可能である.

脂質モデルの検証
研究チームは,この技術の可行性を検証するために,まず,コレステロール (Chol),不飽和型リン酸塩素 (DOPC),スフィンゴミエリン (SM).

(1) スペクトル特性の比較

hyFOPMによって収集された指紋領域スペクトルは,ATR-FTIR結果と非常に一致している. 3つの脂質は区別可能なスペクトルピークを示している:コレステロールは1056cm−1でステロイドリング変形に強い吸収ピークを示します; DOPCは1731cm−1でエステルグループのC=O伸縮振動を特徴とし,スフィンゴミエリンは1645cm−1でアミドI帯,アミドII帯,脂肪酸CH2屈曲振動に対応する.1555cm−1,および1464cm−1,それぞれ.

(2) スペクトル分解と分類能力
指紋領域で15の波番号のみを線形解混に使用すると,コレステロールとスフィンゴミエリンとの間の交差音は 0%に近いが,DOPCの交差音は 23%である.C-H ストレッチ領域で 7 波番号を使用すると,クロスストークは著しく増加します線形差別分析 (LDA) のさらなる適用は,指紋領域またはC-H領域を使用すると平均分類精度は96%に達することを示します.そしてすべての波数を使えば 97%に達します.

(3) 巨大な単粒胞性泡 (GUV) のモデル
研究では,細胞膜をシミュレートするために3種類のGUVを準備しました:モデル1,SMとCholの1:1混合物,密度の高い順序の膜を形成;モデル2, a2:2液体順序と液体不順序の相で共存するDOPC,SM,Cholの混合物と,不順序の液体膜を形成する純粋なDOPCのモデル32852 cm−1 で hyFOPM によって取得された画像は,ナイル赤の?? 光染色によって得られたものと形態学的に一致しています異なる泡のスペクトル特性は純粋な脂質に対応し,混合膜の個々の成分を識別することが確認される.

(4) 品質管理の応用
各型に対して10つの異なるGUVでスペクトル測定を行い,三次相形図をプロットすることで,研究チームは,実際の脂質組成が目標比値 (約40%の差) から偏ったことを発見しました.これは,hyFOPMがGUV準備における品質評価に使用できることを示しています.

生きた 細胞 に 適用 さ れる
この研究では,さらに生きた細胞にhyFOPMを適用し,それぞれ2つの細胞モデルでスフィンゴミエリンとコレステロールの動的変化を観察しました.

(1) A549 細胞におけるスフィンゴミエリン蓄積
人間の肺腺がん細胞 (A549) は,スフィンゴミエリン蓄積を誘発することが期待される抗腫瘍化合物2-ヒドロキソール酸 (2-OHOA) で治療されました.50個の細胞から指紋領域スペクトル (1600~1400cm−1) が採取されました.治療後,ピーク面積は117%増加し,対照群では23%増加した.波数は4本 (2852cm−1 総脂質) でしたタンパク質アミドIIでは1540cm−1,スフィンゴミエリンでは1464cm−1,コレステロールでは1048cm−1) の値が上昇し続けた.コレステロール信号は有意な変化を示さなかった.

(2) HEK 細胞 の コレステロール 積 量
人間の胚性腎臓細胞 (HEK293) は,細胞膜のコレステロールを増やすために,メチルβ-サイクロデクストリン-コレステロール複合体 (MβCD-Chol) と併合して発芽しました.治療後1048cm−1ピーク面積が161%増加した.サイクロデクストリンがコレステロールを供給しながら,いくつかの膜脂質を抽出するという既知の性質に一致する.3000個の細胞の多波数画像により コレステロール信号の上昇が確認されました総脂質信号のわずかな増加とタンパク質信号のわずかな変化です.

意義 と 展望
この研究は,ラベル付けなしに生きた細胞で類似した化学構造を持つ脂質分子を区別する能力を示しています.流光性または同位体ラベルに依存する従来の方法と比較して,hyFOPMは,ラベルの効率性や細胞機能への干渉などの問題を回避します.刺激波数を調整することで,標的脂質のスペクトル特性に柔軟に適応できます..

既存のシステムの指紋領域のスペクトル特異性は,C-H伸縮領域の特異性より優れているため,より多くの脂質亜種を区別する可能性が開かれています.試験では,高度なスペクトル解混技術を組み合わせることでさらに,中赤外線光音顕微鏡は,組織内の画像の深さ150μmを超えることができる.厚いサンプルや in vivo 設定に拡張できるテクノロジーの加速 (例えば,この技術がポイント・オブ・ケア分析やルーティン・ラボ試験へと進めるための重要な方向性です.